cloning

[Tangirl]

cloning

הי,
אודה לעזרתכם.
יש לי שני פלזמידים שמאחד מהם אני לוקחת את האינסרט ומכניסה אותו לשני.
נניח ובפלזמיד שאליו אני אעביר את האינסרט יש לי restriction site מסוג X. אבל, בפלזמיד עם האינסרט יש לי את אותו ה-restriction site לא בדיוק בתחילת האינסרט שלי, אלא קצת לפני. כלומר, אם אני אחתוך כך, אני לוקחת את האינסרט שמעניין אותי ועוד רצף מסויים קצר שבא לפני ולא רלוונטי ליץ
איך זה ישפיע על פעילות הגן?
האם הפרומוטר "ידע" לפעול על הגן על אף שיש רצף (קצר) שמפריד בינו לבין הגן?
מקווה שהסברתי ברור.
תודה

 

[Tangirl]

בטח לא ניסחתי נכון את הקשר בין הפרומוטר לגן

אבל השורה התחתונה היא- האם מה שתיארתי יעבוד בסדר

 

[C H 4]

השאלה היא תיאורטית או מעשית?

למקרה שהיא מעשית, גיליתי לאחרונה טריק שעובד אפילו שתיאורטית אני לא יודעת להסביר למה הוא עובד, היה לנו דיון רב משתתפים בנושא במעבדה- הוסכם שאף אחד לא מבין למה זה עובד, אבל כאמור- עובד.
את יכולה להרים את האינסרט שלך עם פריימרים שמכילים את החלק החתוך של אנזים הרסטריקציה (רק הסטיקי אנד) ואז את לא מסתבכת עם העברה של פריימרים. כלומר תכניסי בקצה הפריימר רק את הסטיקי אנד+ 3 בסיסים רנדומליים לפניו.
כשאני מרימה גן מפלסמיד, אני לא טורחת לכייל את הPCR, פשוט עושה אותו עם אנילינג של 55-60 מעלות לפי מצב הרוח (והתוכנית שכבר קיימת)
לכאורה מכיוון שבקלונינג משתמשים באנזימים שגומרים לסנתז את המקטע בבלאנט אנד זה פשוט לא מסתדר לוגית. בפועל זה עובד וחוסך כל כך הרבה כאבי ראש של חיתוכים

נשאר לך רק לחתוך את הפלסמיד.
&nbsp
יש אנשים שפחות אכפת להם מהפרומוטרים, לדעתי זו טעות. מעדיפה להרים את הגן בלי עודפים אלא אם כן אני בודקת את ה5' או ה3' באופן פרטני

 

[C H 4]

הדגמה כדי שיהיה ברור

נניח שהאנזים שלך הוא xhoI
הרצף שלו הוא: CTCGAG
הוא משאיר קצה סטיקי של TCGA
אז תתכנני פריימר כזה:
CAT-TCGA-ATGNNNNNNNN
כמובן שהN מיצג את הפריימר הספציפי שלך
עוד כמובן שזה הורס את אתר הרסטריקציה אחרי ההכנסה של האינסרט, אז אם תכננת לבדוק בחיתוך זה לא יעבוד.

 

[Tangirl]

השאלה הייתה תיאורטית

הי,
תודה רבה.
השאלה שלי תיאורטית. זרקו אותנו לכתוב פרוטוקל תכנון ניסוי (with the finest details) אחרי הרצאה של 3 שעות שבה פעם ראשונה נחשפתי לכל העסק. בקטע של google is your best friend..
לא עד הסוף הבנתי את התשובה שלך אבל זה בגלל שאני בשלבי התחלה של להבין איך בונים פריימרים ומתי אני צריכה אותם (כלומר מתי אני צריכה PCR).
לגבי השאלה המקורית שלי- אמנם הסתבר שאני סתם דיסלקטית ודווקא כן יש לי את הרסטריקשן סייטס תואמים בשני הפלזמידים בדיוק במקום הנכון, אז זה בסדר.
אבל כייון שכבר העליתי את השאלה, אם אני מבינה נכון את התשובה שלך (בלי להכנס לפרטים)- במקרה שיש לי איזשהם קצוות עופדים, אני כן אצטרך לעשות איזשהו סוג של התאמה, נכון? כלומר, אני לא יכולה פשוט להתעלם מזה ולקוות שיעבוד?
חוזרת לגוגל, שאולי עצבנתי אותו, אבל הוא לא ממש מתנהג אלי כמו פרנד..

 

[C H 4]

בשאלה תיאורטית התשובה שלי מאוד לא רלוונטית

וגם יורידו לך עליה ציון כי בעקרון זה לא אמור לעבוד

בדרך כלל ברמה של שאלות תיאורטיות אין ממש צורך לעשות התאמות. אם זה נראה לך כמו מקטע ארוך מידי, אפשר תמיד לעשות PCR לגן עם פריימרים שמכילים אתרי חיתוך. מוסיפים את הרצפים לפני ואחרי הרצף של הגן, טיפים לאיך עושים את זה נכון מופיעים באתרים של אנזימי רסטריקציה, המוכר שבהם הוא nebcutter.